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最近几年，单细胞测序技术（scRNA-seq）发展迅速，SCI发文量也是逐年飙升。起初，由于价格昂贵及技术门槛高，scRNA-seq被拉到很高的逼格。但是自2015年以来，随着Micro-well、Drop-seq等技术的出现，scRNA-seq目前已经广泛普及。

（图1，2012年-2020年scRNA-seq发文量）

scRNA-seq的研究已经涉及到肿瘤学、免疫学、发育生物学和神经科学等众多领域。下面我们简单看几个scRNA-seq在以上领域的应用案例。

1)     scRNA-seq在肿瘤中的应用

由哈佛大学和麻省理工学院合作，从单细胞水平揭秘头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的肿瘤微环境中恶性和非恶性细胞的异质性，并解析了转移相关的上皮细胞向间充质细胞转化（p-EMT）的程序。该文2017年发表在Cell杂志上，共检测了18例头颈部鳞状细胞癌患者的6000个细胞。

（图2）

2018年6月，北京大学张泽民教授课题组，在单细胞水平绘制了非小细胞肺癌（NSCLC）T细胞免疫图谱，揭示了NSCLC的T细胞的亚群分类、组织分布、肿瘤内群体异质性及药物靶基因的表达情况，鉴定了跨组织分布的T细胞类群及亚群间潜在的状态转换关系，这对于NSCLC诊断和治疗具有重大意义。该文发表在杂志NatureMedicine上。

（图3）

2)    scRNA-seq在免疫学中的应用

胸腺发育对于获得性免疫系统起着至关重要的作用，2018年6月，麻省大学医学院（马萨诸塞大学）Kernfeld和Genga等人，在单细胞水平通过scRNA-seq检测发育8天的胸腺组织，共检测了24,279个细胞。研究揭示了胸腺细胞的异质性、细胞类型、以及胸腺细胞的发育轨迹，并精确指出基质和血液群体中的细胞特异性表达模式。该文发表于杂志Immumity。

（图4）

3)     scRNA-seq在发育学中的应用

2019年5月，日内瓦大学的研究人员利用scRNA-seq方法，追踪了小鼠胚胎中原始祖细胞（AP）及其子代神经元的分子谱系特征。并鉴定到一组核心的进化保守的，具有时间规律的，促使AP从内部驱动到更强的感受态的一类基因。该研究发表于Science杂志。

（图5）

4)     scRNA-seq在神经科学中的应用

单细胞测序的技术难点在于将组织解离成单个的细胞，多少老师的单细胞实验卡在了单细胞悬液制备这一步，尤其是神经科学领域的研究。现今，我们的科研团队已攻破神经细胞分离这一难点，并保证细胞活性在90%以上。

接下来我们着重解析一篇scRNA-seq技术在神经科学领域的应用的文献。这篇文章仅用单细胞测序和原位杂交实验就发到12分以上，这比传统的做实验发文章耗时短，科研费用需求少。如果老师没太多时间做试验并想发高分文章，可以参考这个模式。

2019年10月份，由剑桥大学和哈佛医学院共同合作，发表一篇题为Single-cell Transcriptomic Atlas of theHuman Retina Identifies Cell Types Associated With Age-Related MacularDegeneration的文章——通过对视网膜的单细胞测序揭示了与年龄相关的黄斑变性的细胞类型，杂志nature communications，影响因子12.121。

（图6）

背景

老年性黄斑变性（AMD）是老年人失明的主要原因之一，大多发生于45岁以上，是当前老年人致盲的重要疾病。人的视网膜有多种细胞类型组成，其中有杆状和锥状的感光器细胞，上皮细胞，神经细胞和胶质细胞等。胶质细胞又包括大胶质细胞（Müller胶质细胞和星形胶质细胞）和小胶质细胞。

检测平台：本文使用microfluidics（微流体）和Seq-Well两个独立的单细胞测序（scRNA-seq）平台，对人类视网膜进行scRNA-seq。

样本来源：  来自于6例死后的人视网膜黄斑组织和周围的正常视网膜组织。

方   法：  单细胞测序，原位杂交验证实验，GWAS的富集分析。

检测细胞量：microfluidics和Seq-Well两个平台分别检测了20,091和3,248个细胞。

研究成果：  确定了和AMD相关的细胞类型。最后，基于GWAS的富集分析确定胶质细胞、血管细胞和视锥感光细胞与AMD相关。

结果展示

1. 人类视网膜神经胶质的多样性

虽然已经明确人类视网膜中神经细胞类型，但是，对于大胶质细胞的复杂性还不清楚。单细胞转录分析揭示了人类视网膜的多样性，研究设计流程和样品准备见图7。

（图7）

Microfluidics scRNA-seq绘制视网膜细胞标记基因的热图，Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达基因（图8）。

（图8）

通过scRNA-seq发现了三种与AMD相关的胶质细胞的亚型见图9。

第一种亚型：是一类新的星形胶质细胞，这种亚型在视网膜周围显著富集。

第二种亚型：表现出多个与AMD相关的高表达基因，如COL4A3、血管内皮生长因子(VEGFA)、HTRA1等，并且在黄斑样本中显著富集。

第三种亚型：可以表达较高水平的铁蛋白，研究表明Müller胶质细胞的缺失能够导致视网膜中铁积累并与AMD的发生有关，提示这种亚群在调节铁离子水平上起关键作用。

 （图9）

2. AMD相关风险基因的细胞类型特异性表达

之前的一项GWAS研究发现了34个与AMD相关的风险基因位点。基于上述研究作者首先分析了这34个风险位点周围的基因（共585个特异性基因）如图10。并进一步利用微流体scRNA-seq分析了AMD相关基因的细胞类型特异性，结果发现，在Müller神经胶质细胞和星形胶质细胞中均表达585个特异性基因。

（图10）

最后作者通过荧光原位杂交实验，验证了高通量单细胞测序中检测的与AMD相关的风险基因（CFI、TIMP3、TM4SF1）的表达情况（图11）。

（图11）

3. AMD遗传风险与特定细胞类型的关联。

最后，为了确定细胞类型是否与AMD风险基因相关，作者利用MAGMA分析了每个细胞类型中优先表达的一组基因。研究发现锥光感受器、大胶质细胞、小胶质细胞和血管细胞最能预测患AMD的风险（图12）。

（图12）

结论

该研究提供了一个成年人视网膜单细胞图谱，并确定了具有预测AMD遗传风险的潜在致病的细胞类型，此结果增进了我们对正常视网膜生物学及疾病发病机理的认识。

兵家有句话：“顺势而为，乘势而上”，在这么好的科研形式下，不借着这股风气发篇单细胞测序的文章总有点说不过去。有人说科研没有捷径，但是小编想说不是没有捷径，而是有捷径的时候就看你有没有勇气往前走。

总而言之，要想发高分文章少不了新技术的支持。单细胞测序就是现在最佳的选择。有意向的老师可以添加下面我们的微信号，私信联系我们。

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